ניטרול מהיר של SARS-CoV-2 בעזרת קרינת UV-LED עמוקה

תקציר

התפשטות זיהומי מחלת וירוס הקורונה 2019 (COVID-19) החדשה ברחבי העולם, העלתה צורך במניעה ובשליטה על התפשטות SARS-CoV-2. כלים אשר מנטרלים במהירות וירוסים יכולים להוריד את הסיכוי להתפשטות זיהום דרך אירוסולים ומגע. מחקר in vitro זה מדגים כי הקרנה בעזרת דיודה מפיצת אור אולטרה-סגול עמוק (DUV-LED) באורך גל של 280 +- 5 ננומטר, מנטרלת באופן מהיר זן של SARS-CoV-2 אשר נאסף ממטופל COVID-19. מצופה כי פיתוח כלים אשר נושאים DUV-LED ימנע את התפשטות הוירוס דרך האוויר ולאחר מגע עם חפצים מזוהמים.

הירוקו אינאגקי, המעבדה למחקר במחלקת החדשנות הרפואית, אוניברסיטת מיאזאקי, יפן
אקוצוקי סאיטו, המחלקה למדעים וטרינריים, אוניברסיטת מיאזקי, יפן
הירונובו סוגיאמה, המרכז לבקרת מחלות בבע״ח, אוניברסיטת מיאזאקי, יפן
טמאקי אוקביאשי, ניקיסו בע״מ, טוקיו, יפן
שואיצ׳י פוג׳ימוטו, המחלקה לרפואה המו-וסקולרית ואיברים מלאכותיים, אוניברסיטת מיאזקי, יפן

מכתב

מגפת וירוס הקורונה SARS-CoV-2 החדשה, התפשטה באופן עולמי ושמה מדינות במצבים חדשים, אשר משתנים במהירות. ארגון הבריאות העולמי (WHO) הבהיר כי יותר מ-5.3 מיליון מקרי תחלואה של COVID-19 ו-342,000 מקרי מוות דווחו ל-WHO עד ל-25 במאי 2020. הוירוס המדבק מזוהה בדגימות מקנה הנשימה, באתרים מסוימים באף ובלוע, ובצואה של מטופלי COVID-19. לאחרונה, זן מדבק של SARS-CoV-2 בודד מדגימת שתן של מטופל COVID-19. SARS-CoV-2 ניתן לאיתור גם באירוסולים עד ל-3 שעות, על גבי נחושת עד ל-4 שעות, על גבי קרטון עד ל-24 שעות ועל גבי פלסטיק פלדת אל-חלד עד ל-2-3 ימים. כדי למנוע חשיפה לחומרים מזוהמים (זיהום כתוצאה ממגע), באשר היא אחת מדרכי ההדבקה העיקריות, היגיינת ידיים בעזרת אלכוהול מומלצת, אך יעילותה במניעת התפשטות זיהומי SARS-CoV-2 עלולה להיות בלתי מספקת.

דיודה מפיצת אור אולטרה סגול עמוק (DUV-LED) אשר מפיצה אורך גל שבין 250-300 ננומטר דווחה בעבר כמנטרלת בצורה יעילה מיקרואורגניזמים, כולל חיידקים, ווירוסים ופטריות, אך השפעותיה על SARS-CoV-2 טרם דווחו. אנו בחנו את היעילות האנטי-וויראלית של הקרנה ע”י DUV-LED, אשר מפיצה אורך גל בתחום צר (280 +- 5 ננומטר), כנגד SARS-CoV-2.

זן של SARS-CoV-2 אשר בודד ממטופל שנדבק ב-COVID-19 בספינת התענוגות Diamond Princess ביפן בפברואר 2020, נאסף מהמוסד לבריאות ציבורית בקנגאווה. הוירוס הושתל בתאי Vero שהיו בתרבית במדיום חיוני מינימלי (MEM), אשר הכיל 2% סרום שור עוברי (FBS). 48 שעות לאחר הדבקת התאים, עותקים של הוירוס נאספו ע”י הנוזל העליון של התרבית לצנטריפוגה ב-3,000 סיבובים לדקה למשך 10 דקות. לאחר מכן הנוזלים נשמרו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עותקי הווירוס נמהלו בבופר פוספט-תמיסת מלח ותוקנו ל-2.0 x 104 PFU למ”ל. לצורך בחינת ניטרול ה-DUV-LED, עותקי ווירוס (150 מיקרוליטר) מוקמו במרכזה של צלחת פטרי בעלת קוטר של 60 מ”מ והוקרנו ב-3.75 mW/cm2 במרחק עבודה של 20 מ”מ בטווח של כמה פעמים (n=3 לכל 1,10,20,30, או 60 שניות). כל סדרה של עותקי וירוסים אשר הוקרנה ב-DUV-LED נמהלה באופן סדרתי בשלבים של פי 10, ולאחר מכן הורכבה על גבי שכבות בודדות של Vero בצלחת של 12 באריות. לאחר השריית הווירוס למשך של שעתיים, נוספה לשכבת התאים תמיסת MEM המכילה 1% קרבוקסי-מתיל צלולוז ו-2% FBS (ריכוז סופי). התאים הוכנסו לאינקובציה למשך של 72 שעות באינקובטור פחמן דו חמצני, ולאחר מכן נבחנו ההשפעות הציטופטיות תחת מיקרוסקופ. תרבית ווירוס אשר לא עברה הקרנה שימשה כביקורת. כדי לחשב PFU, התאים קובעו ב-10% פורמלין למשך 30 דקות, לאחר מכן הוכתמו ב-0.1% תמיסת מתילן כחולה. ההשפעות האנטיוויראליות של הקרנות ה-DUV-LED נבדקו תוך שימוש ביחס logPFU, אשר חושב כך: יחס = log10(Nt/N0), כאשר Nt הוא מספר ה-PFU של הדגימה אשר הוקרנה ב-UV, ו-N0 הוא מספר ה-PFU של הדגימה אשר לא הוקרנה. בנוסף, קצב הפחתת ריכוז התמיסה המדבקת חושב בתור (1-1/10logPFU ratio) x 100 (%). כלל הניסויים בוצעו במעבדת BSL-3.

אנו צפינו בהשפעה ציטופאטית משמעותית על תאים אשר הודבקו בווירוס ללא הקרנת DUV-LED. בניגוד לכך, תאים אשר הודבקו בווירוס והוקרנו למשך של 60 שניות הדגימו מורפולוגיה דומה מאוד לזו של תאים נורמליים. להפתעתנו, תאים אשר הודבקו בווירוס והוקרנו למשך שניה אחת הדגימו שינוי מינימלי. בדיקת הפלאקים חשפה כי הקרנה של DUV-LED לזמן קצר ניטרלה באופן מהיר את SARS-CoV-2. באופן אשר ראוי לציון, קצב הפחתת ריכוז התמיסה המדבקת, של 87.4%, זוהה כבר בהקרנות עותקי ווירוסים במשכים של שניה אחת, והקצב היה 99.9% בהקרנות של 10 שניות. תוצאות אלו מציעות כי DUV-LED ניטרל באופן משמעותי את SARS-CoV-2 בהקרנה, גם למשכים קצרים.

UV-LEDs אשר מקרינים במגוון של אורכי גל, כדוגמת UV-A (320-400 ננומטר), UV-B (280-320 ננומטר), ו-UV-C (100-280 ננומטר), שומשו על מנת לנטרל מגוון זנים פתוגניים, כולל חיידקים, ווירוסים ופטריות. כלים אשר נושאים UV-LEDs עכשיו מתחילים להיכנס לשימוש בתחומי הרפואה. UV-C נחשב לטווח היעיל ביותר כקוטל חיידקים, ופועל דרך יצירת פוטו-פרודוקטים בדנ”א. דימרים אלו של פירימידינים מפריעים לתהליך השעתוק, התרגום, והשכפול של הדנ”א, ובסופו של דבר מובילים לניטרל המיקרואורגניזמים. יעילות הניטרול הנ”ל עלולה להיות תלויה לא רק באורך הגל המוקרן, אלא גם בגורמים כדוגמת מקבל ההקרנה (כלומר, הזן החיידקי), האור הנפלט, והתנאים הסביבתיים. ה-DUV-LED בו השתמשנו הוא בעל המאפיינים של תחום צר של אורכי גל ושל כוח רב לזמני חשיפה קצרים ולשימוש ארוך טווח. מחקר זה הדגים בפעם הראשונה ניטרול מהיר של SARS-CoV-2 ע”י הקרנת DUV-LED. השפעות ציטופאטיות נצפו בתאי ביקורת Vero אשר הודבקו ב-SARS-CoV-2, אך לא בתאים אשר הוקרנו ב-DUV-LED למשך רק 10 שניות. כמו גם בסביבות קהילתיות, גם סביבות שירותי הבריאות חשופות להדבקה ולהתפשטות של SARS-CoV-2, והיציבות של SARS-CoV-2 בארוסולים ועל גבי משטחים ככל הנראה תורמת להפצת הווירוס בסביבות הרפואיות. נכון לכרגע לא קיימים חיסונים, נוגדנים מנטרלים, או תרופות לטיפול או למניעת זיהום של SARS-CoV-2. ע”י חשיפת העובדה שניתן לנטרל את SARS-CoV-2 ע”י הקרנת DUV-LED לזמן קצר, מחקר זה מספק נתוני בסיס שימושיים לצורך הבטחת סביבה רפואית בטוחה יותר. פיתוח כלים אשר נושאים DUV-LED צפוי למנוע את התפשטות הוירוס דרך האוויר ולאחר מגע  במשטחים מזוהמים.

תומכים

H.I. ו– H.S. הגו את המחקר. A.S. ו– T.O. ניהלו את הניסויים הקשורים בווירוס. S.F. תרם לעיצוב ופיקוח על המחקר.

הכרה

אנו רוצים להודות לד״ר Tomohiko Takasaki ו-Jun-Ichi Sakuragi, מ-Kanagawa Prefectural Institue of Public Health על שסיפקו את הנגיף  SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027.

גילוי נאות

חלק ממשכורתו של H.S. משולמת ע״י חברת ניקיסו בע״מ, טוקיו, יפן. ניקיסו גם סיפקה את הדיודה המפיצה אנרגיה אולטרה בגולה עמוקה לצורך בדיקה. לניקיסו לא היה שום חלק בתכנון המחקר, איסוף המידע וניתוחו, ההחלטה לפרסם או ההכנה של המחקר. הכותבים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

תרשים 1.

האפקט המדכא של קרינת DUV על נגיף SARS-CoV-2. (A) שינויים ציטופאתיים בתאי VERO שנפגעו עלידי הנגיף ללא קרינת DUV-LED (0 שניות), ולאחר הקרנה בקרינת DUV-LED למשך 1,10,20,30 או 60 שניות. (B) היווצרות פלאק על תאי Vero. ריכוז הנגיף בתמיסה שהוקרנה ע״י קרינת DUV-LED דולל פי 100 והפך לבלתי מזיק כנגד תאי Vero. מוצגת תוצאה לדוגמה. (C) ניטרול תלוי זמן של SARS-CoV-2 באמצעות קרינת DUV-LED. התוצאות המובאות הינן החציוון וסטיית התקן של מדידות משולשות. הקו המקווקוו מסמן את גבול הזיהוי.

טבלה S1

הבדלים במידת כושר ההדבקה של  של הנגיף לאחר הקרנה בקרינת DUV-LED לתקופות שונות.